1.最小二乘均值的定义和背景
1.1 最小二乘均值的定义（来自lsmeans包简介）
定义：least-squares means (LS means for short) for a linear model are simply predictions-or averages thereof-over a regular grid of predictor settings which I call the reference grid, 简称为LS means。
Ls means的历史可以追溯到1960年，1977年Harvey写出了计算机程序LSML，并且贡献了SAS软件中的HARVEY过程。以后，lsmeans声明加入到了SAS的各种过程如GLM中。SAS、单机版ASReml、R中的包lsmeans和ASReml-R都可以计算LS means。
在协方差分析模型中 LS means与协变量校正均值（covariate-adjusted means）相同。在不平衡因子试验中，每一个因子的LS means跟主效应均值非常相似，但是进行了不平衡校正。后边这种解释，跟未加权的均值（unweighted means)方法非常相似。
LS means 并不是很好理解，术语本身就会令人迷惑。Searle（1980）详细的讨论了对于各种因子、嵌套和协方差模型，该如何定义最小二乘均值。Searle建议利用术语"predicted marginal means"来代替"least-squares means",可能更为合理。
需要强调的两点：
- 最小二乘均值根据参考表格（reference grid）计算
- 一旦建立了参考表格，最小二乘均值就是基于表格的简单预测，或者说是预测值列表的边际均值（marginal means）。
1.2 参考表格（reference grid）
为了计算预测值，我们需要定义一套参考水平（见下文）；
- 参考水平的组合构成参考表格
- 参考水平的获取方法
- 如果是因子，那么因子的每个水平作为参考水平；
- 如果是协变量，那么用协变量的总体均值作为参考水平；
- 因此参考表格涉及到模型和数据两个层面。
1.2.1 橙子售卖数据集
oranges的数据集(36行×6列)结构如下：
- 两个品种，对应两个价格（price1和price2）和两个销量（sales1和sales2）；
- 然后还有store和day两个列变量，分别表示售卖的商店和时间；
- store和day两个变量为因子类型，价格为整数类型，销量为数字类型。
dim(oranges)
## [1] 36 6
head(oranges)
## store day price1 price2 sales1 sales2
## 1 1 1 37 61 11.3208 0.0047
## 2 1 2 37 37 12.9151 0.0037
## 3 1 3 45 53 18.8947 7.5429
## 4 1 4 41 41 14.6739 7.0652
## 5 1 5 57 41 8.6493 21.2085
## 6 1 6 49 33 9.5238 16.6667
str(oranges)
## 'data.frame': 36 obs. of 6 variables:
## $ store : Factor w/ 6 levels "1","2","3","4",..: 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 ...
## $ day : Factor w/ 6 levels "1","2","3","4",..: 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 ...
## $ price1: int 37 37 45 41 57 49 49 53 53 53 ...
## $ price2: int 61 37 53 41 41 33 49 53 45 53 ...
## $ sales1: num 11.32 12.92 18.89 14.67 8.65 ...
## $ sales2: num 0.0047 0.0037 7.5429 7.0652 21.2085 ...
1.2.2 计算最小二乘均值
1.2.2.1 建立模型
建立模型，分析影响品种1销量（Sales1）的主要因素:
- 在模型中包括store,day, price1和price2等4个因素;
- 其中store和day由于是因子变量，因此作为固定效应；price1和price2作为协变量;
- 这里把price2纳入模型，是因为品种2的价格也会影响品种1的销量。
oranges.lm1 <- lm(sales1 ~ price1 + price2 + store + day , data = oranges)
anova(oranges.lm1)
## Analysis of Variance Table
##
## Response: sales1
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## price1 1 516.59 516.59 29.0996 1.763e-05 ***
## price2 1 62.73 62.73 3.5334 0.072873 .
## store 5 212.95 42.59 2.3991 0.068548 .
## day 5 433.10 86.62 4.8793 0.003456 **
## Residuals 23 408.31 17.75
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
其中lm()函数为R自带的函数，包括在stats包中。anova()给出了方差分析表。
从表中可以看出，price2对sales1的影响未达到显著水平。
1.2.2.2 建立参考表格
lsmeans包中的ref.grid()可以用来建立参考表格，代码如下：
oranges.rg1 <- ref.grid(oranges.lm1)
oranges.rg1
## 'ref.grid' object with variables:
## price1 = 51.222
## price2 = 48.556
## store = 1, 2, 3, 4, 5, 6
## day = 1, 2, 3, 4, 5, 6
从上边结果中可以看出，两个价格协变量price1和price2用它们的均值作为参考水平。
两个因子用它们各自的6个水平作为参考水平。因此参考表格共计包括$1×1×6×6=36$个水平组合。
1.2.2.3 获得不同参考水平组合的预测值
LS means基于参考表格的预测值进行计算。参考表格的预测值可以通过summary()或者predict()获得。
oranges.rg1.prediction <- summary(oranges.rg1)
oranges.rg1.prediction
## price1 price2 store day prediction SE df
## 51.22222 48.55556 1 1 2.918413 2.717559 23
## 51.22222 48.55556 2 1 4.961475 2.377742 23
## 51.22222 48.55556 3 1 3.200891 2.377742 23
## 51.22222 48.55556 4 1 6.198757 2.363673 23
## 51.22222 48.55556 5 1 5.543218 2.363116 23
## 51.22222 48.55556 6 1 10.563739 2.366683 23
## 51.22222 48.55556 1 2 3.848804 2.701335 23
## 51.22222 48.55556 2 2 5.891866 2.335579 23
## 51.22222 48.55556 3 2 4.131282 2.335579 23
## 51.22222 48.55556 4 2 7.129148 2.352186 23
## 51.22222 48.55556 5 2 6.473609 2.330670 23
## 51.22222 48.55556 6 2 11.494130 2.339254 23
## 51.22222 48.55556 1 3 11.018569 2.534556 23
## 51.22222 48.55556 2 3 13.061630 2.416451 23
## 51.22222 48.55556 3 3 11.301047 2.416451 23
## 51.22222 48.55556 4 3 14.298913 2.431679 23
## 51.22222 48.55556 5 3 13.643374 2.363673 23
## 51.22222 48.55556 6 3 18.663895 2.347839 23
## 51.22222 48.55556 1 4 6.096286 2.651370 23
## 51.22222 48.55556 2 4 8.139348 2.352186 23
## 51.22222 48.55556 3 4 6.378765 2.352186 23
## 51.22222 48.55556 4 4 9.376630 2.388653 23
## 51.22222 48.55556 5 4 8.721091 2.337599 23
## 51.22222 48.55556 6 4 13.741613 2.341304 23
## 51.22222 48.55556 1 5 12.795800 2.444597 23
## 51.22222 48.55556 2 5 14.838862 2.466155 23
## 51.22222 48.55556 3 5 13.078278 2.466155 23
## 51.22222 48.55556 4 5 16.076144 2.519089 23
## 51.22222 48.55556 5 5 15.420605 2.395544 23
## 51.22222 48.55556 6 5 20.441126 2.370343 23
## 51.22222 48.55556 1 6 8.748779 2.786176 23
## 51.22222 48.55556 2 6 10.791841 2.337599 23
## 51.22222 48.55556 3 6 9.031258 2.337599 23
## 51.22222 48.55556 4 6 12.029123 2.364688 23
## 51.22222 48.55556 5 6 11.373584 2.352318 23
## 51.22222 48.55556 6 6 16.394106 2.370539 23
1.2.2.4 计算最小二乘均值
有了基于参考表格的预测值后，通过lsmeans包中的lsmeans()函数可以直接获得某一个因子各水平的最小二乘均值。
lsmeans(oranges.rg1,"day")
## day lsmean SE df lower.CL upper.CL
## 1 5.564415 1.768083 23 1.906856 9.221974
## 2 6.494807 1.728959 23 2.918183 10.071430
## 3 13.664571 1.751505 23 10.041308 17.287835
## 4 8.742289 1.733920 23 5.155403 12.329175
## 5 15.441803 1.785809 23 11.747576 19.136029
## 6 11.394782 1.766726 23 7.740031 15.049533
##
## Results are averaged over the levels of: store
## Confidence level used: 0.95
上面结果，给出了每一天品种1销量(Sales1)的最小二乘均值。
可以从看出，周三、周五的销量最高，周六次之。
1.2.2.5 其他方法验证
上述结果实际上是对oranges.rg1.prediction预测数据集，按照day不同水平进行均值汇总输出的结果。
利用dplyr包相关函数手动计算day六个水平的最小二乘均值：
suppressMessages(require(dplyr))
oranges.rg1.day.lsmeans <- oranges.rg1.prediction %>%
group_by(day) %>%
summarise(lsmean=mean(prediction))
oranges.rg1.day.lsmeans
## # A tibble: 6 x 2
## day lsmean
## <fctr> <dbl>
## 1 1 5.564415
## 2 2 6.494807
## 3 3 13.664571
## 4 4 8.742289
## 5 5 15.441803
## 6 6 11.394782
进一步利用ASReml-R中的相关函数，计算day六个水平的最小二乘均值，相互验证。
suppressMessages(require(asreml))
oranges.asreml <-
asreml(
fixed = sales1 ~ -1+store + day + price1 + price2 ,
rcov = ~ units,
family = asreml.gaussian(),
data = oranges,
maxiter = 100
)
## ASReml: Thu Jun 15 12:34:50 2017
##
## LogLik S2 DF wall cpu
## -60.6324 17.7525 23 12:34:50 0.0
## -60.6324 17.7525 23 12:34:50 0.0
##
## Finished on: Thu Jun 15 12:34:50 2017
##
## LogLikelihood Converged
oranges.asreml.lsmeans <- predict(oranges.asreml,classify = "day")
## ASReml: Thu Jun 15 12:34:53 2017
##
## LogLik S2 DF wall cpu
## -60.6324 17.7525 23 12:34:53 0.0
## -60.6324 17.7525 23 12:34:53 0.0
##
## Finished on: Thu Jun 15 12:34:53 2017
##
## LogLikelihood Converged
oranges.asreml.lsmeans$predictions$pvals
##
## Notes:
## - The predictions are obtained by averaging across the hypertable
## calculated from model terms constructed solely from factors in
## the averaging and classify sets.
## - Use "average" to move ignored factors into the averaging set.
##
## - price1 evaluated at average value of 51.222222
## - price2 evaluated at average value of 48.555556
## - The SIMPLE averaging set: store
##
## day predicted.value standard.error est.status
## 1 1 5.564415 1.768083 Estimable
## 2 2 6.494807 1.728959 Estimable
## 3 3 13.664571 1.751505 Estimable
## 4 4 8.742289 1.733920 Estimable
## 5 5 15.441803 1.785808 Estimable
## 6 6 11.394782 1.766726 Estimable
从结果来看，利用lsmeans，手动汇总和asreml给出的结果都是一致的。上述结果有助于加深对于LS means的理解。
1.2.3 调整参考表格
在计算LS means的时候，可以考虑设置协变量的值，以及要预测的因子的水平。
譬如，我们可以设置在price1=50，price2=40以及price2=60水平上，只预测2,3,4三天的最小二乘均值。
org.lsm <- lsmeans(oranges.lm1,"day",by="price2",at=list(price1=50,price2=c(40,60),day=c("2","3","4")))
org.lsm
## price2 = 40:
## day lsmean SE df lower.CL upper.CL
## 2 6.236227 1.887106 23 2.332452 10.14000
## 3 13.405992 2.119376 23 9.021730 17.79025
## 4 8.483710 1.866510 23 4.622540 12.34488
##
## price2 = 60:
## day lsmean SE df lower.CL upper.CL
## 2 9.213169 2.109448 23 4.849443 13.57689
## 3 16.382933 1.905216 23 12.441693 20.32417
## 4 11.460651 2.178054 23 6.955003 15.96630
##
## Results are averaged over the levels of: store
## Confidence level used: 0.95
2. 基于ASReml单机版的LS means实例分析
在动物育种中 ，lsmeans经常用作不同群体性能的比较。 假定有3个群体，每个群体包含数量不等的家系，本文的目的是比较不同群体的生长性能，即收获体重的差异。
2.1 固定效应
如果模型中同时包括固定效应和随机效应，首先建立只包括固定效应（除残差随机效应外）的模型，通过Wald F统计检验显著性。
在ASReml中，Wald F统计检验方法的方法有两种，F-inc和F-con。F-inc表示incremental form，F-con表示conditional form。
模型：
$$y_{ijkln}=\mu+Pop_{i}+Sex_{j}+Tank_{k}+Sex_{i}×Tank_{k}+\\ Tbw_{l}(Sex_{i}×Tank_{k})+e_{ijkln}$$
ASReml代码：
!PATH 1 #估计固定效应的显著性
!cycle 3 6 7 8
Input2014/growthG$I.csv !SKIP 1 !MAXIT 150 !EXTRA 5 !MVINCLUDE !SUM
TABULATE HarvestBW StockingMeanBW !stats ~ FamilyClass
!DDF
HarvestBW ~ mu FamilyClass Sex TankID Sex.TankID Sex.TankID.StockingMeanBW
ASreml输出的结果文件.asr中的LogL值的结果（8的结果）：
Univariate analysis of HarvestBW
Summary of 11989 records retained of 11989 read
Warning: Fewer levels found in AnimalID than specified
Warning: Fewer levels found in SireID than specified
Warning: Fewer levels found in DamID than specified
Warning: Fewer levels found in Generation than specified
Forming 16 equations: 16 dense.
Initial updates will be shrunk by factor 0.316
Notice: LogL values are reported relative to a base of -30000.000
Notice: 6 singularities detected in design matrix.
1 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
2 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
3 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
4 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
5 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
6 LogL=-4887.55 S2= 123.83 11979 df
ASreml输出的结果文件.asr中的Wald F检验结果：所有固定效应及其交互效应都是显著的。
因此需要将他们都包括在分析模型中。
Wald F statistics
Source of Variation NumDF DenDF F-inc P-inc
14 mu 1 11979.0 0.18E+06 <.001
7 FamilyClass 2 11979.0 47.90 <.001
5 Sex 1 11979.0 8420.41 <.001
6 TankID 1 11979.0 803.90 <.001
15 Sex.TankID 1 11979.0 32.54 <.001
17 Sex.TankID.StockingMeanBW 4 11979.0 321.53 <.001
2.2 随机效应
每个群体中包括数量不等的家系，为了去除群体内家系结构的差异，需要把家系作为随机效应去除掉。 模型：
$$y_{ijkln}=\mu+Pop_{i}+Sex_{j}+Tank_{k}+Sex_{i}×Tank_{k}+\\ Tbw_{l}(Sex_{i}×Tank_{k})+Fam_{l}(Pop_{i})+e_{ijkln}$$
ASReml代码
!PATH 2 # PATH 1中模型的结果表明，所有的固定效应和协变量都是显著的，进一步加入家系效应,作为随机效应
!cycle 3 6 7 8
Input2014/growthG$I.csv !SKIP 1 !MAXIT 150 !EXTRA 5 !MVINCLUDE !SUM
TABULATE HarvestBW StockingMeanBW !stats ~ FamilyClass
!DDF
HarvestBW ~ mu FamilyClass Sex TankID Sex.TankID Sex.TankID.StockingMeanBW,
!r FamilyClass.FamilyID
LogL值：LogL=-4573.14，大于2.1部分LogL=-4887.55，因此需要将全同胞家系组效应作为随机效应保留在分析模型中。
Univariate analysis of HarvestBW
Summary of 11989 records retained of 11989 read
Warning: Fewer levels found in AnimalID than specified
Warning: Fewer levels found in SireID than specified
Warning: Fewer levels found in DamID than specified
Warning: Fewer levels found in Generation than specified
QUALIFIERS: predict FamilyClass !TDIFF
Forming 388 equations: 16 dense.
Initial updates will be shrunk by factor 0.316
Notice: LogL values are reported relative to a base of -30000.000
Notice: 6 singularities detected in design matrix.
1 LogL=-4573.86 S2= 114.78 11979 df 0.1000
2 LogL=-4573.45 S2= 114.84 11979 df 0.9397E-01
3 LogL=-4573.19 S2= 114.90 11979 df 0.8755E-01
4 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8345E-01
5 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
6 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
7 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
8 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
9 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
10 LogL=-4573.14 S2= 114.95 11979 df 0.8358E-01
Final parameter values 0.8358E-01
Wald F检验
Wald F statistics
Source of Variation NumDF DenDF F-inc P-inc
14 mu 1 119.0 20904.91 <.001
7 FamilyClass 2 118.2 5.15 0.007
5 Sex 1 11922.3 8887.92 <.001
6 TankID 1 11912.6 795.62 <.001
15 Sex.TankID 1 11891.1 37.25 <.001
17 Sex.TankID.StockingMeanBW 4 898.5 145.53 <.001
2.3 模型中进一步考虑平滑样本曲线
在模型分析中，通过初始体重变量对收获体重进行校正。由于不同群体的初始体重，可能会存在一个较大的差别，不同初始体重，生长速度存在不同，因此用三次平滑样本曲线，可以更加精确地对结果进行校正。 ASReml代码：通过spl()函数来实现上述功能。
!PATH 3 #在PATH 2的基础上，进一步加入spl(StockingMeanBW)随机效应
!cycle 3 6 7 8
Input2014/growthG$I.csv !SKIP 1 !MAXIT 150 !EXTRA 5 !MVINCLUDE !SUM
TABULATE HarvestBW StockingMeanBW !stats ~ FamilyClass
!DDF
HarvestBW ~ mu FamilyClass Sex TankID Sex.TankID Sex.TankID.StockingMeanBW,
!r FamilyClass.FamilyID Sex.TankID.spl(StockingMeanBW)
LogL值：与2.2 LogL=-4573.14相比，本次LogL=-4526.67，更大，且似然比检验明显会达到显著水平。因此在模型中应该加入spl函数对收获体重进行校正。
1 LogL=-4592.74 S2= 112.75 11979 df : 1 components restrained
2 LogL=-4549.23 S2= 113.53 11979 df : 1 components restrained
3 LogL=-4527.87 S2= 114.01 11979 df 0.4000E-03 0.5931E-01
4 LogL=-4526.87 S2= 114.20 11979 df 0.1467E-03 0.5565E-01
5 LogL=-4526.68 S2= 114.17 11979 df 0.1847E-03 0.5548E-01
6 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1960E-03 0.5523E-01
7 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1972E-03 0.5517E-01
8 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1973E-03 0.5516E-01
9 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1973E-03 0.5516E-01
10 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1973E-03 0.5516E-01
11 LogL=-4526.67 S2= 114.16 11979 df 0.1973E-03 0.5516E-01
Final parameter values 0.1973E-03 0.5516E-01
Wald F 检验，所有固定效应和协变量均达到极显著水平。
在分析过程中，存在一种情况，模型中只包括固定效应时，各种效应的Wald F检验达到显著或极显著水平。
但是加入随机效应后，原先的固定效应可能会不再显著。
在这种情况下，以没有包括随机效应的模型拟合结果为准，固定效应保留。
Wald F statistics
Source of Variation NumDF DenDF F-inc P-inc
14 mu 1 126.6 19176.67 <.001
7 FamilyClass 2 115.0 8.89 <.001
5 Sex 1 2074.6 4361.97 <.001
6 TankID 1 2162.5 488.94 <.001
15 Sex.TankID 1 2162.0 15.08 <.001
17 Sex.TankID.StockingMeanBW 4 170.1 17.27 <.001
2.4 最小二乘均值
predict FamilyClass !TDIFF
上述语句放在模型语句后边，ASReml生成一个.pvs文件，包括三个群体的最小二乘均值:
Predicted values of HarvestBW
Model terms involving StockingMeanBW are predicted at the average: 1.3630
The SIMPLE averaging set: TankID Sex
The ignored set: FamilyID
FamilyClass Predicted_Value Standard_Error Ecode
SPWP 46.0236 0.7740 E
SP 46.8604 0.3769 E
WP 43.7606 0.8069 E
SED: Standard Error of Difference: Min 0.7881 Mean 0.8848 Max 1.0546
Predicted values with t statistics
46.02
46.86 1.06
43.76 -2.15 -3.82
!TDIFF限定符，给出了最小二乘均值的T统计检验值。在ASReml-R中，提供了predict()函数解析asreml()计算出的模型结果，计算最小二乘均值。
对于lsmeans包，提供了lsmeans()函数，可以对lme4、nlme等线性混合效应模型包的输出结果进行解析，求解最小二乘均值。
Searle SR, Speed FM, Milliken GA (1980). Population marginal means in the linear model: A alternative to least squares means. The American Statistician, 34(4), 216-221.